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溫廷益研究組建立了無痕叠代的DNA組裝新方法

作者: 發布時間:2019.07.18 文章來源:

  DNA組裝與DNA合成技術並稱爲合成生物學的兩大基礎使能技術。在合成生物學和生物工程領域中,“設計-構建-驗證-學習(Design-Build-Test-LearnDBTL的循環工程,精細的遺傳元件無縫拼接以及重複DNA序列(如CRISPRTALEN結合序列)串聯分別需要叠代、無痕和序列重複的DNA組裝技術。目前酶切連接的組裝方法被廣泛的應用于叠代組裝,其中BioBrick組裝法則是最早發展起來的DNA標准化組裝技術,已成爲國際基因工程機器大賽iGEM的組裝標准。然而,BioBrick及其類似的組裝方法在DNA連接處构成6–21 bp的疤痕序列,影響DNA完整性和mRNA正確折疊,且不適用于序列嚴格依賴的遺傳元件的精確組裝。 

 

  中科院微生物所病原室溫廷益研究組建立了基于IIPIIS型限制性內切酶(Restriction EndonucleaseRE)的DNA組裝方法(命名爲PS-Brick)。與在兩端加入RE識別序列的現有DNA組裝技術不同,本方法僅在PS-Brick供體DNA的一端巧妙設計了毗鄰的IIPIISRE識別序列,並且保留了另外一端的PCR産物特性,解決了目前基于REDNA組裝方法普遍存在“疤痕”序列問題。該技術使用IIPRE切割供體DNA産生一個粘性末端,同時保留PCR産物的另一個平末端或加A粘性末端;使用IIPIISRE同時切割載體,IIPRE産生粘性末端,IISRE産生平末端或單堿基粘性末端,雙酶切後IISRE的識別序列脫離載體。由相同IIPRE切割的供體和载体的粘性末端进行连接,组装后的载体重新产生与初始载体相同的毗邻IIP/IISRE識別序列對,作爲下一輪PS-Brick组装的入口,从而实现迭代组装。供體DNA的平末端或加A粘性末端與IISRE切割的载体平末端或单碱基粘性末端进行连接,构成无“疤痕”序列的连接“焊点“,从而实现无痕组装。从供體DNA制備到組裝産物轉化感受態細胞並塗布平板,一輪PS-Brick組裝可在一個工作日內完成。PS-Brick方法的組裝效率達到104–105 CFUs/μg DNA,組裝正確率約爲90%,滿足常規分子克隆和建庫的需求。 

 

  本研究進一步應用PS-Brick方法開展了蘇氨酸和正丙醇代謝工程的研究。應用PS-Brick叠代組裝的特性,開展了多輪 DBTL循環的代謝工程,逐步解除了關鍵酶ThrA的反馈抑制、消除了代谢瓶颈、增强了外排转运途径以及阻断了降解途径,構建了高效的苏氨酸和正丙醇工程菌。除了迭代组装的优点,PS-Brick無痕組裝實現了ThrA飽和突變以及調控翻譯起始的雙順反子元件的精確拼接;PS-Brick重複序列組裝實現了3個含有相同啓動子和sgRNACRISPR基因組編輯序列的串聯整合。 

 

  本研究建立了簡單高效的PS-Brick組裝方法,可同時實現叠代、無痕和序列重複的DNA組裝。現有的DNA組裝技術難以同時實現這三種組裝性能,因而PS-Brick爲合成生物學和代謝工程提供了一種有價值的使能技術。該研究已于近日發表于Biotechnology for Biofuels,微生物所劉樹文博士和博士生肖海涵爲該文的共同第一作者,溫廷益研究員爲通訊作者。該研究得到中國科學院戰略性先導專項A(鴻鹄專項,XDA17010503)、國家自然科學基金(31800073)和中科院青促會(2018117)等項目的資助。 

 

    文章链接:https://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-019-1520-x   

 

PS-Brick組裝流程圖

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